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作成： 1999/01/08 前川 秀彰
データ番号 ：150007
動原体特異プローブを利用した放射線による異常染色体検出システムの構築
目的 ：染色体動原体検出法
研究実施機関名 ：国立感染症研究所 (旧国立予防衛生研究所)
応用分野 ：放射線生物学、細胞生物学、分子遺伝学
概要 ：
放射線誘発染色体異常を的確に認識し自動的に計数するシステムを作ることは、被曝線量を推定する際に非常に有用なものとなる。ヒト染色体のセントロメア近傍に存在するアルファサテライトDNAのコンセンサス配列をプローブとしたFluorescence in situ hybridization (FISH)法により、セントロメア部位を蛍光で染色し、セントロメアを容易にかつ確実に認識できることを示した。それによって放射線被曝試料における、無動原体染色体断片や、二動原体(多動原体)染色体も確実に認識できることを可能とした。
詳細説明 ：
放射線照射により引き起こされる放射線誘発染色体異常は主として、染色体が断裂したことにより起こる無動原体染色体、断裂を起こしたあと他の染色体と融合することにより生じる二動原体(多動原体)染色体、及び一本の染色体が自分自身で融合して生じる環状染色体と言う形で知られている。放射線被曝試料からこれらの染色体異常を計数することにより、その試料が受けた放射線量を推定することが可能であり、これらの染色体異常を的確に認識し自動的に計数するシステムを作ることは、被曝線量を推定する際に非常に有用なものとなる。
さらに、自動化されることにより、多数の試料を処理することが可能になるので、極低線量における染色体異常の検出が可能となる。このことは、放射線のリスク評価を考えるときに重要なファクターであると考える。 われわれは、「放射線による染色体異常の高速自動解析システムに関する研究」において以下のことを進めた。まず、ヒト染色体のセントロメア近傍に存在するアルファサテライトDNAのコンセンサス配列をプローブとしたFluorescence in situ hybridization (FISH)法により、セントロメア部位を蛍光で染色し、セントロメアを容易にかつ確実に認識できることを示した。それによって放射線被曝試料における、無動原体染色体断片や、二動原体(多動原体)染色体も確実に認識できることを可能とした。
図1 蛍光顕微鏡デジタル画像解析システム（原論文1より引用）
図2 蛍光画像解析手順 a)カラーCCDカメラを通した蛍光画像、b)蛍光バックグランドの消去、c)各染色体領域の決定、d) プローブ結合領域の決定（原論文1より引用）
これらのFISHによる結果を蛍光デジタルイメージ顕微鏡(図1)を用いて観察し、蛍光画像処理並びに、相対的蛍光量を算出することにより、各染色体の大きさ(面積)、各染色体のDNA含量及その染色体上のDNAプローブ量を得ることができた。それらの値を二次元プロットすることによりプローブの特性に依存する特定の分布域を設定することができた(図2)。
放射線被曝試料のFISHでの解析において、無動原体染色体断片に関してはアルファサテライトDNAプローブがないもの、すなわちプローブ蛍光量0の集団として自動的に計数する事が可能になり線量を変えて、無動原体断片と思われるプローブ量0に分布するものの出現数を計数したところ、線量に1次元相関する結果を得て、少なくとも無動原体断片の自動計数に関してはこのシステムで解析可能であることがわかった。 しかしながら、二動原体(多動原体)染色体の解析については、各染色体上のセントロメアにおけるアルファサテライトDNAの量的な分布が相対量として1〜4%と広くなっているために、二動原体染色体ではあっても、そのうえにのっているプローブの量は正常の分布範囲の中に入ってしまう場合があり、各染色体上のDNAプローブの相対量のみによる二動原体染色体の識別は適当ではないことがわかった(図3a)。
図3 各染色体の大きさと結合プローブの蛍光量の相対量のプロット a)プローブとして合成したコンセンサスDNA単位を使用、b)プローブとしてCENP-B box配列によるPCR産物を使用、図の下のバーで示されたものは、95%を含む範囲として計算（原論文1より引用）
この問題を解決するために、以下の2点について試みた。1つは、各染色対上のセントロメア部位に存在するアルファサテライトDNAに対して、各染色体でより均一に検出できるプローブの開発である(図3b)。もう1つの方法として、アルファサテライトDNAをプローブとしたFISHの結果をセントロメア部位のマーカーとしてのみ用いて、画像処理による判断で二動原体染色体などの染色体異常を検出していくプログラムを作成した。しかし、結果としては、ばらつきを減少させることができなかった。
コメント ：
詳細概要に示した問題を解決するために試みた2点についてその問題点を述べる。1つは、各染色対上のセントロメ ア部位に存在するアルファサテライトDNAに対して、各染色体でより均一に検出できるプローブの開発である。セントロメア部位とより均一にハイブリダイズさせるために、キネトコア特異的配列と考えられるCENP-B boxに着目し、CENP-B boxを二分するような形PCR(Polymerase Chain Reaction)法によるCENP-B box間の配列の増幅を行い、増幅してきたDNAをプローブとして用いることにより、より均一な状態でのセントロメア部位の検出を試みた。しかしながらCENP-B boxをプライマーとしたPCRによる増幅で得たプローブに関しても、各染色体上のプローブDNA量の偏差に関しては、そのばらつきを1/5程度しか減少させることができなかった。
もう1つの方法として、アルファサテライトDNAをプローブとしたFISHの結果を画像処理を行う場合の手助けとして、すなわちセントロメア部位のマーカーとしてのみ用いて、画像処理による判断で二動原体染色体などの染色体異常を検出していくプログラムを作成した。しかしながら、この方法では結果として通常染色による染色体像の画像認識と比較して、セントロメアの認識についてのみ計算が軽減されるだけで、その後の異常であるか否かの判断に相当量の計算を必要とすることになってしまい、異常の検出速度の点からは改善が期待できないことがわかった。
原論文１ Data source 1：
A quantitative analysis of radiation-induced chromosome aberrations with a fluorescent digital image microscope
Kameoka, Y., Hirata, M., Goto, E., Deng, L.-R., Maekawa, H. and Hashimoto, K.
National Institute of Infectious Diseases (old name; National Institute of Health)
J. Radiat. Res., 33:suppl., 71-79 (1992)
参考資料１ Reference 1：
Application of synthetic DNA probes of human alpha satellite consensus monomer for detection of centromere-involved chromosome abnormalities
Kameoka, Y., Date, T. and Hashimoto, K.
National Institute of Infectious Diseases (old name; National Institute of Health)
Jpn. J. Human Genet. 35: 227-233 (1990)
キーワード：染色体、分子交雑蛍光法、動原体、アルフォイド配列、
Chromosome, FISH (fluorescence in situ hybridization), centoromere, alphoid sequence,
分類コード：150101, 150102, 150201
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